استخالص و تنقية بروتين سي الفعال و د ارسة تأثير المعادن و درجة الح اررة و الرقم الييدروجيني عمى عممية ارتباطو باضداده المحمولة عمى حبيبات الالتكس

Transcript

1 مجمة جامعة النيرين المجمد 1 العدد) 3 ( أيمول 212 ص استخالص و تنقية بروتين سي الفعال و د ارسة تأثير المعادن و درجة الح اررة و الرقم الييدروجيني عمى عممية ارتباطو باضداده المحمولة عمى حبيبات الالتكس حسن مجيد رشيد* أليس كريكور ممكونيان** و لينة عبد الكريم* * قسم عموم الحياة كمية جامعة بغداد. ** قسم التقنيات االحيائية كمية جامعة بغداد. Hassan_bio79@yahoo.com الخالصة 2 جمعت عينة من سائل الجنب (Pleural effusion) من حاالت سريرية مختمفة و بحجم كمي مقداره لغرض لتر 9 استخالص بروتين سي الفعال. استخدمت طريقة لالستخالص معتمدة عمى المسيثين و الكموروفورم التي أعطت منتوج بنقاوة عالية. تمت تنقية العينة المستخمصة باستعمال عمود المبادل األيوني DEAE-Sephadex A- Sephacryl S-3 " واضحة عند ترحيمو كيربائيا إذ كانت نسبة بروتين سي الفعال المسترجعة عمى وسط.PAGE %2 و بنقاوة عالية " " أظير أيون المنغنيز تأثي ار ايجابيا ومن ثم عمود الترشيح بيالم حيث ظير عمى شكل حزمو واحده في ارتباط بروتين سي الفعال مع األضداد المرتبطة بالالتكس أما الكوبمت فكان لو تأثير سمبي و لم يالحظ لمصوديوم أي تأثير في الفعالية أالرتباطيو لبروتين سي الفعال. ت اروحت فعالية بروتين سي الفعال ضمن األرقام الييدروجينية 8-.2 وضمن مدى ح ارري ت اروح من الى º2 م. الكممات المفتاحية: بروتين سي الفعال المسيثين الجنب الكموروفورم. المقدمة اكتشف بروتين سي الفعال سنة 9 من قبل العالمين Tillet و Francis و ىو يعد احد بروتينات استجابة الطور الحاد )استجابة غير متخصصة تنشأ نتيجة لتحطم خموي و جرح نسيجي و التيابات( إذ يرتفع مستواه في مصل الدم إلى أكثر من م هر عن مستواه الطبيعي و قد سجل وجود ىذا البروتين في معظم الحيوانات الفقرية [1]. ينتمي بروتين سي الفعال إلى عائمة البروتينات الخماسية إذ يتألف من خمس وحدات متماثمة تربط بينيم جسور ممحية و أواصر كبريتية و لو وزن جزيئي يت اروح من 2 دالتون و يظير في منطقة الكاما عند ترحيمو كيربائيا" خالل ىالم (PAGE) Polyacrylamid Gel Electrophoresis ولو نقطة تعادل كيربائي مساو" ل ]2[. 4. يمتمك بروتين سي الفعال صفات ارتباطية متخصصة بعضيا يكون بييئة معتمده عمى الكالسيوم )ارتباط بروتين سي الفعال بمادة Phosphocholine الموجود ضمن الجدار الخموي لمبكتريا الممرضة و ال سيما النوع Streptococcus pneumoniae وأخر بييئة غير نظام المتمم التقميدي و الطياية لمبكتريا الممرضة و تقديم المستضد (Antigen presentation) و تحفيز إنتاج الحركيات الخموية االلتيابية []. يعد بروتين سي الفعال من العوامل الميمة لمكشف عن اإلصابة و االلتيابات و ازدادت الد ارسات في نياية العقد الماضي حول نسب ت اركيز بروتين سي الفعال في مصل الدم إذ لوحظ أن ىناك عالقة وثيقة بين زيادة تركيز بروتين سي الفعال و التنبؤ ببعض الحاالت المرضية و ال سيما األم ارض الوعائية القمبية إذ اعتبرت بعض الد ارسات إن مستوى بروتين سي الفعال عامال" تنبؤيا" أكثر دقة من الكوليسترول فيما يخص الجمطات القمبية [6] كما ان بعض الد ارسات أكدت عمى أىمية تحديد نسب بروتين سي الفعال بوصفو عامل تنبؤ ألم ارض االستسقا البنكرياسي [7]. المواد ط ارئق العمل جمع العينات 4 تم جمع عينات السائل الجنبي fluid( )Pleural بواقع - التخصصية مميمتر من مرضى ارقدين في مستشفى الج ارحات مستشفى ابن النفيس يعانون من تجمع السوائل في منطقة الصدر حول غشا الجنب معتمدة عمى الكالسيوم مثل االرتباط بالمواد عديد الشحنة الموجبة ]3 4[. يقوم بروتين سي الفعال بوظائف دفاعيو ميمة مثل تنشيط 23

2 حسن مجيد رشيد تقدير المحتوى البروتيني لمعينات تم تقدير كمية البروتينات الكمية لمعينات و لنواتج عمميات االستخالص و التنقية و ذلك بالرجوع إلى المنحني القياسي لمبروتينات و باستعمال البومين المصل البقري بطريقة فولن لوري.[8] استخالص بروتين سي الفعال أضيف " العينة المركزة و مزجت جيدا دىني غ ارم من مادة المسثين إلى ثم أضيف لمخميط الكالسيوم ). موالري مميمتر من إلى حين الحصول عمى خميط مميمتر من محمول كموريد برقم ىيدروجيني 2 ( بعدىا تمت ديمزة المزيج ضد محمول كموريد الكالسيوم نفسو ولمدة ساعة. عرض الخميط لمنبذ بوساطة المنبذة المبردة و بسرعة 2 دورة/ دقيقة و لمدة دقيقة تم اخذ ال ارسب وغسل بمحمول كموريد الكالسيوم ). موالري و برقم ىيدروجيني 2( و عرض لمنبذ المبرد بسرعة دقيقة. 2 أعيدت عممية الغسل مرتين دورة/ دقيقة و لمده ىيدروجيني بعدىا أخذ ال ارسب و أذيب ب مميمتر من داري فوسفات الصوديوم.2 موالري وبرقم 4. إذابة كاممة لو وأضيف مميمتر من الكموروفورم وتم خمطو بوساطة المحرك االمغناطيسي لمدة ساعة واحدة. بعد انتيا المدة عرض المزيج لمنبذ المبرد وبسرعة 2 دورة/ دقيقة لمدة دقيقة. جمعت الطبقة العميا بوساطة ماصة باستور و وضعت في قنينة معقمة األخرى )9(. تنقية بروتين سي الفعال وأىممت الطبقات المتكونو تم استخدام مرحمتين لتنقية بروتين سي الفعال المستخمص من سائل الجنب باستخدام المسثين و الكموروفورم ىما: كروماتوغ ارفيا التبادل األيوني اجري عمى وفق طريقة بروتين سي الفعال باستخدام Ikuta لتنقية [9] وجماعتو DEAE-Sephadex A- بابعاد ).4( سنتمتر. بدال من المبادل األيوني الموجب DEAE-Cellulose مرحمة الغسل )Wash( تمت.2 بأستخدام 4 مولر من داري عمى عمود المبادل أاليوني دقيقو و بواقع الفوسفات برقم ىيدروجيني. جريان بمعدل.2 مميمتر/ جز. مميمتر/ مرحمو االسترجاع )Elution( تمت باستخدام.2 مولر من داري الفوسفات و برقم ىيدروجيني 4 و تدرج خطي لكموريد الصوديوم ). -( مولرعمى عمود المبادل االيوني و بمعدل جريان مميمتر/ دقيقة و بواقع.2 مميمتر/ جز. كروماتوغ ارفيا الترشيح اليالمي استعمل ليذا الغرض ىالم السيفاكريل اس. ۳ )3-S Sephacryl (.بابعاد )4.4( سنتمتر باستخدام.2 مولر داري الفوسفات و برقم ىيدروجيني 4 و. مولر كموريد الصوديوم و بمعدل جريان. مميمتر/ دقيقة بواقع.2 مميمتر/ جز. عمى وفق طريقة ]9[. د ارسة تأثير بعض المعادن في بروتين سي الفعال المنقى. تمت د ارسة تأثير كموريدات اربعة معادن و بواقع ثالث ت اركيز لكل معدن ىي 2 تأثيرىا في بروتين سي الفعال بتركيز كموريدات المعادن ىي: )1( كموريد الصوديوم NaCl ممي موالر [1]. ودرس. 2 ممغ ارم/ مميمتر و تم تحضير محمول خزين من كموريد الصوديوم بتركيز ممي مولر وبحجم مميمت ارت. وذلك بإذابة.9 غ ارم من الممح في 2 مميمت ارت ما مقطر وأكمل الحجم إلى مميمت ارت. )2( كموريد المنغني ازلمائي MnCl 2.4H 2 O 2 في تم تحضير محمول خزين من كموريد المنغنيز بتركيز 2 ممي مولر و بحجم مميمت ارت و ذلك بإذابة.989 غ ارم من الممح مميمترات ما مقطر مميمترات. )3( كموريد الكوبمت المائي في و من ثم أكمل الحجم إلى CoCl 2.6H 2 O 2 تم تحضير محمول خزين من كموريد الكوبمت بتركيز 2 ممي مولر و بحجم مميمتر و ذلك باذابة.89 غ ارم من الممح حضنت مميمت ارت ما مقطر و أكمل الحجم إلى ساعتين بدرجة مميمت ارت األنابيب الحاوية عمى البروتين والمعادن لمدة م 2 و من ثم مالحظة تأثير المعادن في فعالية بروتين سي الفعال من خالل تحضير تخافيف نصفية لكل معدن ولكل تركيز ومالحظة قابميو البروتين عمى التالزن مع أضداده المرتبطة بحبيبات الالتكس. 22

3 م( د ارسة تأثير الرقم الييدروجيني في بروتين سي الفعال تمت د ارسة تأثير الرقم الييدروجيني بقيم 2 مجمة جامعة النيرين المجمد 1 العدد) 3 ( أيمول 212 ص سي الفعال [11] )HCl( بتركيز. سي الفعال بتركيز إذ في بروتين تم أضافو حامض الييدروكموريك موالري إلى. درجات الرقم الييدروجيني قياس الرقم الصوديوم مميمترات من بروتين ممغرام/ مميمتر لموصول إلى المختمفة و باستعمال جياز الييدروجيني كما تم استعمال ىيدروكسيد )NaOH( بتركيز. إلى درجات الرقم الييدروجيني المختمفة. تم حضن ىذه األنابيب بدرجة لغرض الوصول موالري 4 م و قيست فعالية بروتين سي الفعال بعد مرور ساعتين عن طريق عمل التخافيف النصفية لكل قيمو رقم ىيدروجيني و مالحظة قوة التالزن مع أضداد بروتين سي الفعال المرتبطة بالالتكس. د ارسة تأثير درجات الح ارره في بروتين سي الفعال تم د ارسة تأثير درجات الح اررة في فعالية بروتين سي الفعال و ذلك بحضن البروتين بدرجات ح اررة مختمفة ( حضن استمرت ساعتين [11]. الفعال و بعد مدة تم مالحظة تأثير درجات الح اررة المختمفة في بروتين سي و ذلك بعمل تخافيف نصفية لكل درجة ح اررية و مالحظة ارتباط بروتين سي الفعال مع أضداده المرتبطو بالالتكس. النتائج و المناقشة جمع العينات قدر المحتوى البروتيني اعتمادا عمى المنحني القياسي المستعممة 2 و بحجم كمي يقارب 9 لتر. البومين مصل البقر مايكروغ ارم/ مميمتر الشكل )1( المنحني القياسي لتقدير محتوى البروتينات باستخدام البومين المصل البقري باستخدام طول موجي 6 نانوميتر. استخالص بروتين سي الفعال باستخدام المسثين والكموروفورم مفسفرة أضيفت الكالسيوم الى 1 غ ارمات من مادة المسثين )مادة دىنية )Phospholipid و 2 مميمتر من مميمتر من كموريد عينة سائل الجنب المركزة ألمت ازز بروتين سي الفعال إذ من المعموم أن لبروتين سي الفعال مواقع ارتباط متخصصة لمجاميع الفوسفات groups( )Phosphate معتمدة عمى الكالسيوم )ايونين من الكالسيوم يعمالن عمى ربط مجموعة الفوسفات لكل موقع ارتباط( )flocculant( []. لوحظ تكون ارسب ممبد أبيض يحتوي عمى بروتين سي الفعال )أذيب قسم من ال ارسب في دارئ الفوسفات واختبر بطريقة التالزن( وكانت نسبة االسترجاع لبروتين سي الفعال 47.% )جدول باستعمال البومين المصل البقري شكل -- عدد العينات رقم --(. الجدول )۱( م ارحل استخالص بروتين سي الفعال وكميات البروتين حجم العينة ونوع المعاممة المسترجعة. البروتين الكمي )ممغ ارم( بروتين سي الفعال المتمثل بعيارية التالزن االسترجاع لبروتين سي الفعال % 2 مميمترمن العينة غير المعاممة 16/ مميمتر بعد المعاممة بالمسثين والكموروفورم /1 39 التنقية كروماتوغ ارفيا التبادل األيوني أستعممت العينات المستخمصو بوساطة المسثين والكموروفورم وأجريت المبادل األيوني عممية التبادل األيوني باستخدام عمود DEAE-Sephadex A- بأبعاد

4 االمتصاصية بطول موجي 1x( نانوميتر 28 ) 3 - ب- االمتصاصية بطول موجي نانوميتر 28 1x( ) 3-24 )34 1.6( سنتمتر وقد تم استحصال بروتين سي الفعال من دارئ الفوسفات الحاوي عمى بروتين سي الفعال وبرقم 7 ىيدروجيني )Isoelectric Point( حوالي والذي ىو أعمى من نقطة تساوي الشحنة (pi) 6.4 لبروتين سي الفعال التي ىي وبيذا تكتسب جزيئات بروتين سي الفعال شحنة سالبة تربطيا بجزيئات المبادل األيوني بخالف معظم البروتينات األخرى الموجودة في المستخمص البروتيني - )الشكل بالمبادل باستخدام أ(. تم شطف بروتين. سي الفعال المرتبط مولر دارئ الفوسفات برقم ىيدروجيني 7 وبتدرج ممحي خطي باستخدام كموريد الصوديوم بمدى )-.1( مولر إذ كان تركيز كموريد الصوديوم الالزم لشطف بروتين سي الفعال مساويا إلى ) ( مولر وذلك مقارب لمتركيز الذي استعمل من قبل وجماعتو الشكل)- - الطريقة Ikuta [9] والذي كان ).4.24( مولر و ب( يوضح القمم المنفصمة عمى وفق ىذه وقد شخص وجود بروتين سي الفعال في القمة الثانية في األج از )31-24( و التي كانت موجبة لتفاعل التالزن مع أضداد بروتين سي الفعال المرتبطة بالمالتكس اما القمة األولى والثانية فمم تعط أية نتيجة موجبة )لم تعط تفاعل تالزن( بروتين سي الفعال. مما يدل عمى وجود بروتينات أخرى مع شكمت األج از الموجبة لتفاعل التالزن مع أضداد بروتين سي الفعال حوالي %21 من حجم المستخمص الكمي وبتركيز بروتين كمي الكمية ىي %4. مميمتر ممغ ارم/ اي كانت كمية البروتين ممغ ارم ونسبة بروتين سي الفعال المسترجعة ب- - أ- - الشكل رقم الجز رقم الجز حسن مجيد رشيد )2( تنقية بروتين سي الفعال باستخدام عمود المبادل االيوني -A.DEAE-Sephadex أ- -مرحمة الغسل )Wash( بأستخدام داري أاليوني. مولر من الفوسفات برقم ىيدروجيني 7 عمى عمود المبادل DEAE-Sephadex A- )34 1.6( سنتمتر و بمعدل جريان دقيقة و بواقع 2. مميمتر/ جز. -مرحمة من داري االسترجاع )Elution( باستخدام الفوسفات و برقم ىيدروجيني خطي لكموريد الصوديوم ) بابعاد مميمتر/ مولر و تدرج المبادل االيوني A- DEAE-Sephadex بأبعاد 1.6( 34 ( سنتمتر و بمعدل جريان وبواقع 2. مميمتر/ جز كروماتوغ ارفيا الترشيح استخدم عمود الترشيح اليالمي مميمتر/ دقيقة Sephacryl S-3 بأبعاد )47 1.6( سنتمتر بوصفيا مرحمة ثانية لتنقية -1( مولرعمى عمود بروتين سي الفعال المستخمص بوساطة المسثين والكموروفورم و المنقى جزئيا باستخدام المبادل األيوني DEAE- Sephadex A- المرشح اليالمي باستخدام مولر كموريد الصوديوم وبرقم عمى قمتين )الشكل (. إذ تم استرداد بروتين سي الفعال من. مولر دارئ الفوسفات ىيدروجيني M. M.1 M و تم الحصول

5 االمتصاصية بطول موجي نانوميتر x( ) رقم الجز الشكل )3( كروماتوغرافيا الترشيح اليالمي لمعينو المنقاة جزئيا عمى عمود 3-S Sephacryl بابعاد )47 1.6( سنتمتر باستخدام. مولر داري الفوسفات و برقم ىيدروجيني 7 و.1 مولر كموريد الصوديوم و بمعدل جريان.4 مميمتر/ دقيقة بواقع 2. مميمتر/ جز. إن نتائج أختبار التالزن ألج از القمتين كانت موجبة لألج از )42-36( إذ شكمت ىذه األج از حوالي % مجمة جامعة النيرين المجمد 1 العدد) 3 ( أيمول 212 ص من كمية البروتين المنقى باستخدام كروماتوغ ارفيا التبادل بتركيز بروتين كمي األيوني كمية البروتين الكمية تساوي.6.4 ممغ ارم/ مميمتر أي كانت ممغ ارم استرجاع بروتين سي الفعال % 2 )الجدول (. وكانت نسبة الجدول )2( م ارحل استخالص و تنقية بروتين سي الفعال )تم حساب نسب االسترجاع وذلك باالعتماد عمى عيارية التالزن والتي تمثل تركيز بروتين سي الفعال مضروبا بالحجم وبذلك نحصل عمى كمية البروتين عند كل خطوة وبقسمة الناتج عمى كمية بروتين سي الفعال بالعينة الغير معاممة )1/16X2( تم الحصول عمى نسب االسترجاع لكل خطوة(. حجم العينة ونوع المعاممة 2 مميمتر من العينة غير المعاممة تركيز البروتين (ممغ ارم/مميمتر( 4 البروتين الكمي )ممغ ارم( نسبة بروتين سي الفعال متمثو بعيارية التالزن 16/1 نسبة االسترجاع لبروتين سي الفعال )%( 92 مميمتر بعد المعاممة بالمسثين والكموروفورم 2 مميمتر ناتج من عمود المبادل االيوني /1 4 / Sephadex A- DEAE 17. مميمتر ناتج من الترشيح بيالم Sephacryl S /

6 حسن مجيد رشيد ومن الجدير بالذكر بأن االختالف في طريقة التنقية المستعممة لبروتين سي الفعال عن طريقة Ikuta et al., (1983) بدال من ىو استخدام المبادل DEAE-Sephadex A- DEAE-Cellulose أما عمود الترشيح اليالمي فكان نفسو Sephacryl-3 مع اختالف في طولو. الترحيل الكيربائي بيالم عديد االكريل امايد تعد طريقو الترحيل الكيربائي عمى ىالم عديد االكريل امايد من الط ارئق الشائعة في تقييم قدرة عمميات االستخالص والتنقية لمبروتينات المختمفة إذ يمكن من خالليا تقدير نقاوة المنتوج النيائي و كذلك مالحظة قدرة كل خطوة من خطوات االستخالص والتنقية والتعرف عمى تواجد المموثات )بروتينات غير مرغوبة( التي تتمثل في عدد الحزم المالحظة عند ترحيل العينة و مقارنتيا مع عدد الحزم الظاىرة في العينة غير المعاممة اذ ان A تمثل عينة سائل الجنب غير المعاممة والتي ظيرت بيا تمثل مرحمة االستخالص B و حزم 4 بوساطة المسثين و الكموروفورم وظيرت بيا حزم محددة و مركزة و C تمثل العينة المستخمصة بالمسثين و الكموروفورم و المنقاة باستخدام المبادل األيوني والترشيح اليالمي وظيرت بيا حزمة واحدة محددة و مركزة مع اثار طفيفة جدا لحزمة D اخرى أما كبريتات األمونيوم وظيرت بيا خامسة اقل وضوحا )الشكل (. فتمثل مرحمة االستخالص بأستخدام أمالح حزم واضحة و حزمة C B A D الشكل )4( الترحيل الكيربائي عمى ىالم عديد االكريل أمايد لعينات تمثل م ارحل استخالص و تنقية بروتين سي الفعال A إذ إن مرحمة االستخالص تمثل عينة سائل الجنب غير المعاممة وB بوساطة المسثين و الكموروفورم تمثل C و تمثل العينة المستخمصة بالمسثين والكموروفورم والمنقاة باستخدام المبادل األيوني والترشيح اليالمي أما D فتمثل مرحمة االستخالص بأستخدام أمالح كبريتات األمونيوم. تأثير بعض المعادن عمى بروتين سي الفعال تمت د ارسة تأثير كل من الكالسيوم و المنغنيز و الكوبمت والصوديوم في فعالية بروتين سي الفعال بت اركيز 2 ممي مولر. إذ كانت النتائج تدل عمى أىمية وجود ايون الكالسيوم ضمن مكونات مستحضر بروتين سي الفعال لما لو تأثير كبير ليس فقط في فعالية البروتين و ارتباطاتو و إنما في تركيب جزيئة بروتين سي الفعال الخماسي إذ يمعب دوار ميما في الربط بين وحداتو الخمسة محافظا بذلك عمى مواقع االرتباط من التغير ج ار االنفصال إلى الوحدات األساسية لقد درس تأثير ايون الكالسيوم في بروتين سي الفعال من قبل العديد من الباحثين و منيم العالم Potempa وجماعتو [2] الذين أوضحوا ان غياب الكالسيوم وتواجد ت اركيز عالية من اليوريا مع بروتين سي الفعال سوف يؤدي إلى تحور في مواقع االرتباط و في سموكو في أثنا الترحيل الكيربائي إذ تؤدي إلى تغير في قيمة نقطة التعادل الكيربائي focusing) (Isoelectric لبروتين سي الفعال من 4. الى 2. كما انو يصبح أكثر سرعة أثنا الترحيل أي يظير في منطقة ألفا ) ( بدال من منطقة الكاما )γ( بينما جزيئة بروتين سي الفعال المحوره سوف تحتفظ بالقميل من صفاتيا المستضدية التي كانت موجودة في الجزيئة األصل الخماسية. كما أظير الباحث إن تأثير الح اررة )ح ارةر 4 م لمده 2 دقائق( يكون مؤث ار في جزيئو بروتين سي الفعال بغياب الكالسيوم كما استنتج ان ىذه التأثي ارت الناجمة عن اليوريا و الح اررة يمكن أن يقمل من تأثيرىا أو تثبط بوساطة إضافة.4 ممي مولر أو أكثر من الكالسيوم و أضاف أيضا إن بروتين سي الفعال المحور يفقد قابميتو في االرتباط المعتمد عمى الكالسيوم بعديد السكريد سي )C-Polysaccharide( عمى الرغم من احتفاظيا بقابميتيا باالرتباط بالمواد عديدة الشحنة الموجبة. وجد العالم Myles وجماعتو [13] أن بروتين سي الفعال المنقى حديثا يعاني من تحمالت ذاتية dissociation) (Spontaneous في حالو عدم إضافة كموريد الكالسيوم إليو و إن ىذا التحمل يزداد بازدياد مدة الخزن. اما تأثير المعادن األخرى الصوديوم الكوبمت المنغنيز بوجود الكالسيوم في ارتباط بروتين سي الفعال باألضداد المرتبطة بالالتكس كان متباينا )الشكل 2(. إن إضافة أي معدن من المعادن المذكوةر دون الكالسيوم سوف يؤدي إلى عممية التحمل الذاتي )Autolysis( الطبيعية لبروتين سي الفعال )وىي عممية تحول جزيئو بروتين سي الفعال الخماسية إلى جزيئو أحاديو بسبب غياب 23

7 عيارية التالزن مجمة جامعة النيرين المجمد 1 العدد) 3 ( أيمول 212 ص ايونات الكالسيوم (Ca++) التي تعمل عمى ربط الوحدات التركيبية بعضيا مع بعض( [1]. سبب أيون المنغنيز (Mn) تنشيطا طفيفا لقوة تفاعل بروتين سي الفعال مع أضداده المرتبطو بالالتكس أما الكوبمت (Co) فقد اظير تثبيطا في شده التفاعل و ازداد ىذا التثبيط بزيادة تركي هز. ايون الصوديوم )Na( لم يظير أي تأثير لتفاعل بروتين سي الفعال إال انو يوصى بو من قبل الشركات المتخصصة بتحضير العدة التجارية )Atlas( وذلك بإضافة كموريد الصوديوم ممي مولر إلى مستحضر بروتين سي الفعال أو إلى أضداد بروتين سي الفعال لغرض الحفاظ عميو بالتعاون مع ايونات الكالسيوم. إذ أن بعض العدد التجارية التي تنتج لمتحري عن بروتين سي الفعال تحوي ضمن مكونات الكاشف عمى كموريد الصوديوم )NaCl( بتركيز ممي مولر. النتائج اعاله كانت مطابقة لما جا بو العالم Potempa وجماعتو [14] مع االختالف في طريقة قياس الفعالية حيث اعتمد الباحث عمى فعالية ارتباط بروتين سي الفعال بمادة Phosphorylcholine بالالتكس. بدال من ارتباط البروتين باألضداد المرتبطة 1/ /8 1/4 1/2 التراكيس 1 ملي مولر 4 ملي مولر ملي مولر Co Na Mn تركيز المعادن )ممي مولر( الشكل )( تأثير بعض المعادن في تفاعل بروتين سي الفعال المقدرة بارتباطو باألضداد المرتبطة بالالتكس بوجود ايون الكالسيوم )تفاعل التالزن(. تأثير الرقم الييدروجيني في بروتين سي الفعال تمت د ارسة تأثير الرقم الييدروجيني في صفات بروتين سي الفعال االرتباطية وتضمنت األرقام الييدروجينية المحصورة ضمن مدى من 9.-4 وبزيادة. رقم ىيدروجيني )12 رقم ىيدروجيني( وتم قياس ىذا التأثير بقابمية بروتين سي الفعال باالرتباط بأضداده المرتبطة بالالتكس ( تفاعل تالزن(. أظيرت األرقام الييدروجينية المنخفضة )اقل من ( تأثي ار شديدا" في فعالية بروتين سي الفعال وصمت إلى تثبيط كامل لتفاعل التالزن مع أضداده المرتبطة بالالتكس أما عند الرقم الييدروجيني فقد وجد ان ىناك تثبيط جزئي يتالشى مع ازدياد قيمة الرقم الييدروجيني وتصل الفعالية االرتباطية لبروتين سي الفعال ذروتيا عند الرقم الييدروجيني المحصور بين 7.-7 ويبدأ بعدىا التثبيط لمفعالية االرتباطية مع زيادة قيمة الرقم الييدروجيني إلى قيم أعمى من 8 لحين الوصول إلى الرقم الييدروجيني 9. والذي يعطي تثبيطا جزئيا غير كامل وكما ىو موضح بالشكل )4(. وقد أوضح العالم [2] ان بروتين سي الفعال يعاني من تغي ارت تركيبية changes( )Conformational معتمدة عمى الرقم الييدروجيني ودعم ىذا التوضيح بوساطة السموك التالقي لمعقد بروتين سي الفعال مع الصبغة التألقية (ANS) S-anilinonaphthalenesulfonate و ال سيما عند غياب ايون الكالسيوم وأيضا بنقاط التعادل الكيربائي إذ كانت 4. عند البد برقم ىيدروجيني 7 وكانت.3 و 4. عندما كان البد برقم ىيدروجيني 23

8 عيارية التالزن عيارية التالزن حسن مجيد رشيد.. أوضح الباحث Lee وجماعتو [16] ان الفعالية االرتباطية لبروتين سي الفعال ببعض المواد تكون ثابتو بوضوح عندما تكون قيمة الرقم الييدروجيني محصورة بين 8-4. بوجود كموريد الكالسيوم وانو يظير نقصانا قميال في معدالت االرتباط عند الرقم الييدروجيني 9 أما عمى الجانب الحامضي فانو يظير ىبوطا حادا في فعاليتو االرتباطية تحت الرقم الييدروجيني 4. تصل إلى انعدام الفعالية تماما عند الرقم الييدروجيني. ىذا االنخفاض في الجانب الحامضي قد يعود الى فقدان بروتين سي الفعال لتركيبو الخماسي الحمقي وتجزه إلى وحداتو و من ثم فقدان بعض مواقعو االرتباطية الميمة التي تؤدي إلى فقدان فعاليتو باالرتباط مع أضداده ومع بعض المواد األخرى ذات األلفة. أوضح العالم Yatvin و جماعتو [17] ان مناطق االلتياب و االخماج تعاني اف ارازتيا ىبوطا في رقميا الييدروجيني يصل إلى 2.2 بعد 4 ساعة من بد االلتياب و ىذا يفسر لنا كون فعالية بروتين سي الفعال تكون عالية في بداية االلتياب )عندما يكون الرقم الييدروجيني مرتفعا ( و إنيا تنخفض بعد 8 ساعة و تتالشى بعد 4 ساعة. قدرتو عمى االرتباط مع أضداده المرتبطة بالالتكس. ويعود ىذا التغير إلى تمسخ بعض جزيئات البروتين أوال و إلى تركيبة بروتين سي الفعال و ىو يعد من عائمة البروتينات الخماسية )بروتينات تتألف جزيئاتيا من خمس وحدات متماثمة مرتبطة مع بعضيا بأواصر كبريتية ثنائيو و بجسور ممحية( إذ تعمل الح اررة عمى تكسير تمك الجسور و األواصر مؤديو إلى تحول البروتين من شكمو األصمي (Native) إلى الشكل المحور (Modified) ذي الوحدة الواحدة و الذي يحوي عمى مواقع ارتباط مغاي ةر لتمك الموجودة في النوع األصل وىذا مشابو لتأثير األرقام الييدروجينية المنخفضة عمى تركيب بروتين سي الفعال. و قد حصل العالم Wang و جماعتو [11] عمى ىذه النتيجة أيضا إذ حصموا عمى بروتين سي الفعال المحور من تعريض البروتين األصل إلى درجة ح ارةر 4 م و لمدة دقيقتين كما إنيم حصموا عمى تدرج في فقدان البروتين لشكمو الخماسي عند تعرضو لدرجات ح اررية بين 2 4 م و متناسبة طرديا مع طول فت هر التعرض. أما عند الدرجات الح اررية المنخفضة فمم يالحظ أي تأثير في بروتين سي الفعال حتى عند خزنو بدرجو صفر مئوي و لمده تجاوزت 4 أشير كما أن عمميو اإلذابة (Thawing) المتكررة لعينات بروتين سي الفعال لم تؤثر فيو إال تاثي ار بسيطا من ناحية التالزن مع األضداد المرتبطة بالالتكس )الشكل 4 (. /16 /3 /3 / /3 /3 PH الشكل )6( تأثير الرقم الييدروجيني في فعالية بروتين سي الفعال المقدرة بارتباطو باألضداد المرتبطة بالالتكس )تفاعل التالزن(. تأثير درجة الح اررة في بروتين سي الفعال تمت د ارسة تأثير درجات الح اررة المختمفة ) 2 4( م في بروتين سي الفعال المنقى و لمدة دقيقة. لوحظ ان الدرجات الح اررية األقل من 2 م لم يكن ليا تأثير في بروتين سي الفعال إذ يبقى البروتين محافظا عمى شكمو الخماسي و لم تقل شدة ارتباطو مع أضداده المرتبطة بالالتكس أما عند معاممو البروتين بالدرجات الح اررية المرتفعة 2 4 م فقد لوحظ ان بروتين سي الفعال يفقد فعاليتو تدريجيا إلى أن يصل إلى مرحمة عدم شكل )7( تأثير درجات الح اررة في فعالية بروتين سي الفعال المقدرة بارتباطو باألضداد المرتبطة بالالتكس )تفاعل التالزن(. / درجه الحرارة م /3 References [1] Steel, D. M. and whitehead, A. S. The major acute phase reactants: C-reactive

9 مجمة جامعة النيرين المجمد 1 العدد) 3 ( أيمول 212 ص [12] Szalai, A. J.; Agrawal, A. Greenhough, T. J. and Volonakis, J. E. C-reactive protein: Structural biology and host defence function. Clin. Chem. Lab. Med. 37 (3): (1999). [13] Myles, D. A. A.; Rule, S. A.; Delucas, L. J.; Babu, Y. S.; Xu, Y. Volanakis, J. E.; Bugg, C. E.; Bailey, S. and Greenhough, T. J. Regulation function studies of Human C-reactive protein. J. Mol. Biol. 216: (199). [14] Potempa, L. A.; Kubak, B. M. and Gewurz, H. Effect of divalent metal iones and ph upon the binding reactivity of human serum amyloid P-component, a C- reactive protein homologue, for Zymosan, preferential reactivity in the presence of Copper and Acidic ph. J. Biol. Chem : (198). [1] Tsujimoto, M.; Inoue, k. and Nojima, S.. Purification and charachterization of Human Serum C- reactive protein. J. Biochem. 94: (1983). [16] Lee, R. T.; Takagahara, I. and Lee, Y. C.. Mapping the Binding areas of human C- reactive protein for phosphorylcholine andpolycationic compounds. J. Biol. Chem. 277 (1): (21). [17] Yatvin, M. B.; Kreutz, W.; Horwitz, B. A. and Shinitzky, M. ph sensitive liposomes: Possible clinical Implications. Science. 21: (198). Abstract Nine liters of pleural fluid or Pleural effusion samples were collected from patients suffer from different clinical cases. C-reactive protein was extractcted from the pleural fluid using lecithin and chloroform gave high purity product. The purification of C-reactive protein was carried out by using ion exchange chromatography (DEAE Sephadex A ) and gel filtration (Sephacryl S 3). The percentage of the recovered C-reactive protein was 3% of the total amount of C-reactive protein characterized with high purity. The purity was confirmed by polyacryl amide gel electrophoresis (PAGE) which revealed one band. The effect of the ions (Mn, Co, Na) used on C-reactive protein showed that the protein, Serum amyloid p component and serum amyloid a protein. Immunol Today 1: (1994). [2] Potempa, L. A.; Maldonado, B. A.; Laurent, P.; Zemel, E. S. and Gewurz, H. Antigenic, electrophoretic and binding alternation of human C-reactive protein and modified selectively in the absence of calcium Mol. Immunol. 2: (1983). [3] Potempa, L. A.; Siegel, J. N. and Gewurz, H. Binding reactiving and phosphocholine. J. Immunol. 127: (1981). [4] Hoff, H. F.; Lie, j. T.; Titus, J. l.; Bayardo, R. J.; Jackson, R. L.; DeBakey, M. E. and Gotto, A. M. Lipoprotein in atherosclerotic lesions-localized by immunoflurescence of apo-low density lipoproteins in human atherosclerotic arteries from normals and hyperlipoproteinaemics. Arch. Pathol. 99:23 (197). [] Duclos, T. W. Function of c-reactive protein. Ann Med. 32: (2). [6] Ridker, P. M.; Rifai, N.; Rose, L. Comparasion of C- reactive protein and low- density lipo protein cholesterol levels in the predication of first cardiovascular events. N. Eng. J. Med. 47: (22). [7] Barauskas, G.; Svagzdys, S. and Maleckas, A. C-reactive protein in early prediction of pancreatic necrosis. MEDICINA. 4 (2): (24). [8] Lowry, O. H.; Rosebrouch, N. J.; Earr, A. L. and Randall, R. J. protein measurement with the folin phenol reagent. J. Boil. Chem. 193: (191). [9] Ikuta, T.; Okubo, H.; Yukimura, H. Ishibashi, H.. Purification of C-reactive protein. Biochem. Int. 6 (2): (1983). [1] Dong, A.; Caughey, W. S. and Duclos,T. W.. Effect of Calcium, Magnesium, and Phosphorylcholine on secondary structures of human C-reactive protein and serum Amyloid P-component observed by infrared spectroscopy. J. Biol. Chem : (1994). [11] Wang, H-W.; Wu, Y.; Chen, Y. and Sui, S-F. Polymorphism of structural forms of C-reactive protein. Int. J. Mol. Med. 9: (22). 31

10 حسن مجيد رشيد manganese ion activate the reaction between the C-reactive protein and the antibodies bounded on latex. At the contrary, the cobalt ion produced a negative results on the same reaction, whereas the sodium ion showed no effect. The activity of C-reactive protein was within a ph range of 4.-8 and a temperature ranged of -4 ºc. 3

11 مجمة جامعة النيرين المجمد 1 العدد) 3 ( أيمول 212 ص